激光掃描體視顯微鏡采集的注意事項

激光掃描體視顯微鏡對于要觀察的區(qū)域，應(yīng)先用明視場顯微鏡和普通熒光顯微鏡進行定位，當然也可使用共聚焦系統(tǒng)的體視顯微鏡進行定位。但對于大多數(shù)初學者或非專業(yè)研究人員來說，在只使用共聚焦模式的情況下，常很難找到合適的焦平面。所以應(yīng)該學會使用共聚焦系統(tǒng)配備的顯微鏡，以常規(guī)模式預(yù)觀察樣品，因為要在一張含有數(shù)百個胚胎的標本中找出特定發(fā)育時期的某種基因的表達非常困難，如直接采用共聚焦模式掃描標本，常很費時。許多儀器具備快速掃描功能，可在一定程度上彌補這種缺陷，但在快掃模式下，其分辨率低。因此，當尋找少見的現(xiàn)象時，較容易的方法是使用普通模式觀察切片，一旦發(fā)現(xiàn)即刻切換到共聚焦模式進行圖像采集。

成功進行共聚焦圖像采集的關(guān)鍵是掌握透鏡NA，針孔大小和圖像亮度之間的互相配合，對于亮度，應(yīng)以可獲得最佳圖像的最小激光強度為標準，即在保證成像的情況下，激光功率應(yīng)盡可能小。可使用軟件的放大功能放大圖像，并將所得的圖像與高NA物鏡所得的圖像進行比較。在體視顯微鏡特定成像參數(shù)的設(shè)定操作時，應(yīng)在標本要觀察的特定區(qū)域以外進行，防止有價值的區(qū)域發(fā)生光漂白。常包括設(shè)定PMT探測器的增益和背底水平，以及何時的針孔大小，保證在可接受的分辨率和足夠的反差之間獲得平衡，使用最低的激光功率以避免發(fā)生過多的光漂白。許多儀器具有顏色表，有助于設(shè)定圖像中的正確動態(tài)范圍。在8比特系統(tǒng)中，該表將最黑的像素設(shè)定為0.為偽彩綠色，而最亮的像素設(shè)定為255，為偽紅色。增益和背底水平以及針孔的調(diào)節(jié)，使其變化范圍在0-255之間，這種調(diào)節(jié)也可通過肉眼進行。但在進行實際圖像采集時，標本的熒光不均勻，可能超出范圍，因此，亮的區(qū)域可能遮蓋暗的區(qū)域。

采集的圖像常儲存在計算機的硬盤中，而后再進行拷貝。通常在圖像采集過程中，應(yīng)采集盡可能多的圖像，如果需要刪除，可在隨后的圖像處理過程中刪除不滿意的圖像。有時開始看似不滿意的圖像，在日后的進一步復(fù)審中可能變得價值非凡，因此，在進行圖像刪除時，應(yīng)慎之又慎！要與以前制備標本時各項條件保持一致，再復(fù)制制備標本非常苦難，有時是不可能的。